En aplicaciones de ingeniería de proteínas que implican mutagénesis y expresión de proteínas a partir de ADN recombinante, los genes sintéticos ofrecen muchas ventajas sobre el uso de genes clonados de origen natural. Al especificar con precisión la secuencia de nucleótidos, se puede garantizar el uso óptimo de codones para el huésped de expresión y se pueden incorporar sitios de restricción convenientes según sea necesario, lo que facilita la mutagénesis y la subclonación en casete.
La síntesis de incluso un gen relativamente pequeño generalmente se ha considerado una tarea difícil y que requiere mucho tiempo, que es mejor dejar en manos de laboratorios especializados. Sin embargo, se han desarrollado técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ofrece ventajas, tales como:
- Ahorro de costes.
- Ahorro de mano de obra.
- Se simplifica enormemente el proceso de síntesis de genes.
- Tiene el potencial para la síntesis de genes significativamente más grandes que las técnicas establecidas actualmente.
Aplicaciones de la PCR en la obtención de oligonucleótidos y genes sintéticos
Los genes sintéticos se ensamblan convencionalmente por concatenación de oligonucleótidos más cortos. En general, ambas cadenas de ADN se sintetizan completamente como oligonucleótidos solapantes cortos que se fosforilan, hibridan y ligan para generar el producto de longitud completa. El coste de la síntesis se puede reducir sintetizando oligonucleótidos que representan la secuencia parcial de cada hebra, y los huecos en el producto hibridado se «rellenan» usando ADN polimerasa antes de la ligadura.
En la práctica, ambos métodos dan un bajo rendimiento del producto de longitud completa y requieren amplificación por clonación antes de cualquier manipulación adicional del gen sintetizado. Recientemente, se ha descrito un procedimiento de PCR en el que se sintetizó químicamente un oligonucleótido de 234 bases y se usaron cebadores para amplificar cualquier molécula de longitud completa que resultara de la síntesis química.
Aunque este procedimiento aumenta eficazmente la longitud de la secuencia que se puede sintetizar directamente con un rendimiento útil, la longitud es todavía relativamente corta en comparación incluso con un gen estructural de tamaño moderado. Los genes también se pueden ensamblar mediante el método de corte y empalme por extensión superpuesta, en las que los productos de PCR se purifican separándolos de sus cebadores de amplificación y se extienden entre sí para producir un producto más grande. Este producto se amplifica simultáneamente por la inclusión de cebadores flanqueantes más pequeños.
¿Cuál es la importancia de los oligonucleótidos en la biología molecular?
Se puede decir con justicia que los oligonucleótidos sintéticos son el combustible que impulsa el motor de la biología molecular. Por lo tanto, disponer de medios para la síntesis de estos compuestos es cada vez más importante. Casi todas las técnicas en uso hoy en día en biología molecular emplean ADN o ARN sintetizados químicamente. Esto incluye:
- PCR.
- PCR en Tiempo real.
- Secuenciación de ADN.
- Mutagénesis dirigida al sitio.
- Ensayos de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP).
- Micromatrices.
- El mundo en rápida expansión de los ARN pequeños.
Sin embargo, a diferencia de otros reactivos, los oligonucleótidos no son artículos que puedan almacenarse, hasta que se necesiten. Cada oligonucleótido se fabrica a medida de acuerdo con las necesidades específicas del investigador individual y se purifica de acuerdo con la aplicación para la que está destinado. En los últimos años, los avances en las químicas de síntesis de oligonucleótidos, así como en las tecnologías de purificación y control de calidad, han llevado a aumentos sustanciales tanto en la calidad como en el rendimiento y a disminuciones sustanciales en el costo.
Para la PCR, la mayoría de los cebadores están en el intervalo de 20 a 28 metros. Esto significa que una síntesis estándar será de entre el 85% y el 90% de longitud completa. La PCR es un proceso muy tolerante en el sentido de que la masa abrumadora de producto de longitud completa será suficiente para producir el ampliación de interés en una masa igualmente abrumadora. Por lo tanto, para la PCR, hay poca necesidad de purificación más allá de la desalación que elimina las sales orgánicas generadas durante el proceso de desprotección final.
Los termocicladores de Kalstein en la síntesis de oligonucleótidos
Los oligonucleótidos son fundamentales para el desarrollo de la biología molecular, y su síntesis empleando la PCR puede llevarse a cabo con el empleo de termocicladores confiables, como los diseñados por el fabricante de equipos de Kalstein. Algunos de estos equipos vienen equipados con una pantalla táctil con la cual se puede programar el trabajo o seleccionar algunos de los métodos preconfigurados, los cuales pueden ser modificados y cargados mediante un programa compatible. En las páginas AQUI y AQUI, se puede consultar precios, realizar cotización, compra y otros detalles técnicos de estos equipos.