La electroforesis es una técnica de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz de naturaleza porosa. Entre las principales aplicaciones de la electroforesis podemos mencionar:
Determinación del punto isoeléctrico
Mediante isoelectroenfoque se obtiene una medida del punto isoeléctrico de las proteínas (pHI o pI).
Isoenzimas
La electroforesis, específicamente el isoelectoenfoque permite analizar rutinariamente las variantes de una enzima, con pequeñas diferencias en su estructura y en su actividad enzimática.
Determinación de la masa molecular
Por medio de la electroforesis se puede obtener una estimación de la masa molecular (en kDa) de proteínas empleando SDS-PAGE, y de fragmentos de DNA (en pb). En ambos casos, en uno de los pocillos del gel se carga una mezcla de moléculas patrón de tamaño conocido, con el fin de poder trazar la curva de calibración. Para las proteínas, la validez del dato obtenido depende de que la desnaturalización con SDS haya sido completa y de que se hayan separado las subunidades gracias a la reducción con mercaptoetanol; además, la presencia de oligosacáridos en las glicoproteínas altera la movilidad, que ya no proporciona valores de masa molecular fiables.
Si queremos hacer una estimación de la masa molecular de una proteína, se aplica en uno de los pocillos de un gel SDS-PAGE una mezcla de proteínas de una sola subunidad, de tamaño conocido, denominadas “patrones” o “marcadores de masa molecular”. Tras su separación en la electroforesis, se revelan y se representa para todas las bandas la movilidad (distancia avanzada o, mejor, el cociente entre ésta y el avance del frente de electroforesis) frente al logaritmo del tamaño (masa molecular relativa, Mr). Sobre la línea de regresión se interpolan las distancias de avance de las muestras problema, calculando así su masa molecular aparente.
En el caso de querer conocer el tamaño de fragmentos de ADN, se aplica en uno de los pocillos del gel una mezcla de fragmentos de DNA de tamaño conocido, denominados “patrones”, “marcadores de masa molecular”(DNA ladder). Tras su separación en la electroforesis, se revelan y se representa para todas las bandas la movilidad (distancia avanzada o, mejor, cociente entre ésta y el avance del frente de electroforesis) frente al logaritmo del tamaño (longitud en pb). Sobre la línea de regresión se interpolan las distancias de avance de las muestras problema, calculando así su tamaño en pb.
Mapas de restricción
El ensayo del ADN con enzimas de restricción, es una de las formas de estudiar la secuencia de los ácidos nucleicos, y luego analizar mediante electroforesis en gel de agarosa los fragmentos resultantes e intentar reconstruir la secuencia de la molécula original formando su mapa de restricción, uno de los tipos de mapa físico, y es una de las aplicaciones particulares de la electroforesis.
Secuenciación de ácidos nucleicos
La obtención de la secuencia completa, nucleótido a nucleótido, también depende del análisis electroforético de fragmentos de DNA, mediante el método químico de Maxam y Gilbert o por el método enzimático de Sanger. Se utilizan en este caso geles de poliacrilamida, debido al tamaño pequeño de los fragmentos, pudiéndose resolver fragmentos que se diferencian en un solo nucleótido.
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